Combibest testa izmantošana HIV diagnostikā. Mūsdienīgas HIV infekcijas diagnostikas metodes Video: mūsdienu enzīmu imūnanalīze

Savlaicīga HIV infekcijas diagnostika kļūst par ārkārtīgi svarīgu pasākumu, jo agrāka ārstēšana lielā mērā var noteikt slimības tālāko attīstību un paildzināt pacienta dzīvi. Pēdējos gados ir panākts ievērojams progress šīs briesmīgās slimības noteikšanas jomā: vecās pārbaudes sistēmas tiek aizstātas ar modernākām, izmeklēšanas metodes kļūst pieejamākas, un to precizitāte ir ievērojami palielināta.

Šajā rakstā mēs runāsim par mūsdienīgām HIV infekcijas diagnostikas metodēm, kuras ir noderīgi zināt, lai savlaicīgi ārstētu šo problēmu un uzturētu normālu pacienta dzīves kvalitāti.

HIV diagnostikas metodes

Krievijā HIV infekcijas diagnosticēšanai tiek veikta standarta procedūra, kas ietver divus līmeņus:

ELISA testu sistēma (skrīninga analīze);
imūnblotēšana (IB).

Var izmantot arī citas diagnostikas metodes:

eksprestesti.

ELISA testu sistēmas

Diagnozes pirmajā posmā HIV infekcijas noteikšanai tiek izmantots skrīninga tests (ELISA), kura pamatā ir HIV proteīni, kas izveidoti laboratorijās, kas uztver specifiskas antivielas, kas organismā veidojas, reaģējot uz infekciju. Pēc to mijiedarbības ar testa sistēmas reaģentiem (enzīmiem) mainās indikatora krāsa. Turklāt šīs krāsu izmaiņas tiek apstrādātas ar speciālu aprīkojumu, kas nosaka veiktās analīzes rezultātu.

Šādi ELISA testi spēj uzrādīt rezultātus dažu nedēļu laikā pēc HIV infekcijas ievadīšanas. Šī analīze nenosaka vīrusa klātbūtni, bet nosaka antivielu veidošanos pret to. Dažreiz cilvēka organismā antivielu veidošanās pret HIV sākas pēc 2 nedēļām pēc inficēšanās, bet lielākajai daļai cilvēku tās tiek ražotas vēlāk, pēc 3-6 nedēļām.

Ir četras ELISA testu paaudzes ar dažādu jutību. Pēdējos gados biežāk tiek izmantotas III un IV paaudzes testu sistēmas, kuru pamatā ir sintētiskie peptīdi vai rekombinantie proteīni un kurām ir lielāka specifika un precizitāte. Tos var izmantot, lai diagnosticētu HIV infekciju, uzraudzītu HIV izplatību un nodrošinātu drošību, pārbaudot ziedotās asinis. III un IV paaudzes ELISA testu sistēmu precizitāte ir 93-99% (valstīs tiek ražoti jutīgāki testi Rietumeiropa – 99%).

Lai veiktu ELISA testu, no pacienta vēnas ņem 5 ml asiņu. Starp pēdējo ēdienreizi un analīzi jābūt vismaz 8 stundām (parasti to veic no rīta tukšā dūšā). Šādu testu ieteicams veikt ne agrāk kā 3 nedēļas pēc iespējamās inficēšanās (piemēram, pēc neaizsargāta dzimumakta ar jaunu seksuālo partneri).

ELISA testa rezultāti tiek iegūti pēc 2-10 dienām:

negatīvs rezultāts: norāda uz HIV infekcijas neesamību un neprasa nosūtījumu pie speciālista;
viltus negatīvs rezultāts: var novērot infekcijas sākuma stadijā (līdz 3 nedēļām), AIDS vēlākās stadijās ar smagu imūnsupresiju un ar nepareizu asins sagatavošanu;
viltus pozitīvs rezultāts: var novērot dažu slimību un nepareizas asins sagatavošanas gadījumā;
pozitīvs rezultāts: norāda uz inficēšanos ar HIV infekciju, nepieciešama IB un pacienta nosūtīšana pie speciālista AIDS centrā.

Kāpēc ELISA tests var dot viltus pozitīvus rezultātus?

Nepareizi apstrādājot asinis vai pacientiem ar šādiem stāvokļiem un slimībām, var novērot viltus pozitīvus ELISA testa rezultātus HIV noteikšanai:

multiplā mieloma;
infekcijas slimības, ko izraisa Epšteina-Barra vīruss;
stāvoklis pēc ;
autoimūnas slimības;
uz grūtniecības fona;
stāvoklis pēc vakcinācijas.

Iepriekš aprakstīto iemeslu dēļ asinīs var būt nespecifiskas krusteniski reaģējošas antivielas, kuru veidošanos nav izraisījusi HIV infekcija.

Pēdējos gados viltus pozitīvu rezultātu biežums ir ievērojami samazinājies, jo tiek izmantotas III un IV paaudzes testu sistēmas, kas satur jutīgākus peptīdu un rekombinantos proteīnus (tie tiek sintezēti, izmantojot in vitro gēnu inženieriju). Pēc šādu ELISA testu izmantošanas viltus pozitīvu rezultātu biežums ir ievērojami samazinājies un ir aptuveni 0,02-0,5%.

Viltus pozitīvs rezultāts nenozīmē, ka cilvēks ir inficēts ar HIV. Šādos gadījumos PVO iesaka citu ELISA testu (obligātā IV paaudze).

Pacienta asinis tiek nosūtītas uz atsauces vai arbitrāžas laboratoriju ar atzīmi "atkārtot" un pārbaudītas IV paaudzes ELISA testu sistēmā. Ja jaunās analīzes rezultāts ir negatīvs, pirmais rezultāts tiek atzīts par kļūdainu (viltus pozitīvu) un IB netiek veikts. Ja otrā testa rezultāts ir pozitīvs vai apšaubāms, pacientam 4–6 nedēļu laikā jāveic IB, lai apstiprinātu vai atspēkotu HIV infekciju.

imūnblotēšana

Galīgo HIV infekcijas diagnozi var veikt tikai pēc pozitīva imūnblotēšanas (IB) rezultāta iegūšanas. Tās īstenošanai tiek izmantota nitrocelulozes sloksne, uz kuras tiek uzklāti vīrusu proteīni.

Asins paraugu ņemšana IB tiek veikta no vēnas. Pēc tam tas tiek pakļauts īpašai apstrādei un tā serumā esošās olbaltumvielas tiek atdalītas īpašā želejā atbilstoši to lādiņam un molekulmasai (manipulācija tiek veikta uz speciāla aprīkojuma elektriskā lauka ietekmē). Uz asins seruma gēla tiek uzklāta nitrocelulozes sloksne un speciālā kamerā tiek veikta blotēšana (“blotēšana”). Sloksne tiek apstrādāta un, ja izmantotie materiāli satur antivielas pret HIV, tie saistās ar antigēnu joslām uz IB un parādās kā līnijas.

IB tiek uzskatīts par pozitīvu, ja:

saskaņā ar Amerikas CDC kritērijiem - uz sloksnes ir divas vai trīs līnijas gp41, p24, gp120 / gp160;
saskaņā ar Amerikas FDA kritērijiem - uz lentes ir divas līnijas p24, p31 un līnija gp41 vai gp120 / gp160.

99,9% gadījumu pozitīvs IB rezultāts norāda uz HIV infekciju.

Ja nav līniju - IB ir negatīvs.

Identificējot līnijas ar gp160, gp120 un gp41, IB ir apšaubāma. Šādu rezultātu var noteikt, ja:

onkoloģiskās slimības;
grūtniecība;
biežas asins pārliešanas.

Šādos gadījumos ieteicams veikt otru pētījumu, izmantojot cita uzņēmuma komplektu. Ja pēc papildu IB rezultāts paliek apšaubāms, tad novērošana ir nepieciešama sešus mēnešus (IB tiek veikta ik pēc 3 mēnešiem).

polimerāzes ķēdes reakcija

PCR tests var noteikt vīrusa RNS. Tā jutība ir diezgan augsta un ļauj konstatēt HIV infekciju jau 10 dienas pēc inficēšanās. Dažos gadījumos PCR var dot viltus pozitīvus rezultātus, jo tā augstā jutība var reaģēt arī uz antivielām pret citām infekcijām.

Šī diagnostikas tehnika ir dārga, tai nepieciešama īpaša iekārta un augsti kvalificēti speciālisti. Šie iemesli neļauj to veikt iedzīvotāju masveida pārbaudēs.

PCR izmanto šādos gadījumos:

atklāt HIV jaundzimušajiem, kuri dzimuši HIV inficētām mātēm;
atklāt HIV "logu periodā" vai apšaubāmas IB gadījumā;
kontrolēt HIV koncentrāciju asinīs;
donoru asiņu izpētei.

Tikai ar PCR testu HIV diagnoze netiek veikta, bet tiek veikta kā papildu metode diagnostika strīdu risināšanai.

Ekspress metodes

Par vienu no jauninājumiem HIV diagnostikā kļuvuši eksprestesti, kuru rezultātus var novērtēt 10-15 minūšu laikā. Visefektīvākos un precīzākos rezultātus iegūst ar imūnhromatogrāfiskiem testiem, kuru pamatā ir kapilārās plūsmas princips. Tās ir īpašas sloksnes, uz kurām tiek uzklātas asinis vai citi testa šķidrumi (siekalas, urīns). Ja ir antivielas pret HIV, pēc 10-15 minūtēm uz testa parādās krāsaina un kontroles josla - pozitīvs rezultāts. Ja rezultāts ir negatīvs, parādās tikai kontroles līnija.

Tāpat kā ar ELISA testiem, ātrās pārbaudes rezultāti jāapstiprina ar IB analīzi. Tikai pēc tam var noteikt HIV infekcijas diagnozi.

Ir pieejami ekspreskomplekti testēšanai mājās. OraSure Technologies1 (ASV) tests ir FDA apstiprināts, pieejams bez receptes, un to var izmantot HIV noteikšanai. Pēc testa pozitīva rezultāta gadījumā pacientam ieteicams iziet pārbaudi specializētā centrā, lai apstiprinātu diagnozi.

Pārējos mājas lietošanai paredzētos testus FDA vēl nav apstiprinājusi, un to rezultāti var būt ļoti apšaubāmi.

Neskatoties uz to, ka ātrās pārbaudes precizitāte ir zemāka par IV paaudzes ELISA testiem, tos plaši izmanto iedzīvotāju papildu testēšanai.

Pārbaudīt HIV infekciju var jebkurā poliklīnikā, Centrālajā reģionālajā slimnīcā vai specializētajos AIDS centros. Krievijas teritorijā tie tiek turēti absolūti konfidenciāli vai anonīmi. Katrs pacients var sagaidīt medicīnisku vai psiholoģisku konsultāciju pirms vai pēc analīzes. Par HIV testiem būs jāmaksā tikai komercārstniecības iestādēs, valsts klīnikās un slimnīcās tos veic bez maksas.

Informāciju par to, kā var inficēties ar HIV un kādi mīti pastāv par inficēšanās iespējām, lasiet

Vispārīga informācija par pētījumu

HIV (cilvēka imūndeficīta vīruss) ir retrovīrusu ģimenes vīruss, kas inficē šūnas imūnsistēma cilvēks (CD4, T-palīgi). Izraisa AIDS.

HIV-1 ir visizplatītākais vīrusa veids, kas visbiežāk sastopams Krievijā, ASV, Eiropā, Japānā un Austrālijā (parasti B apakštips).

HIV-2 ir rets veids, izplatīts Rietumāfrikā.

Cilvēka imūndeficīta vīrusa diagnostikai tiek izmantota kombinētā ceturtās paaudzes testu sistēma, kas spēj noteikt HIV infekciju jau 2 nedēļas pēc vīrusa nonākšanas asinīs, savukārt pirmās paaudzes testu sistēmas to dara tikai 6-12 nedēļas. pēc inficēšanās.

Šī kombinētā HIV testa priekšrocība ir tā, ka, izmantojot antivielas pret HIV-1 p24 kā reaģentus, tiek atklāts specifisks p24 antigēns (vīrusa kapsīda proteīns), ko ar šo testu var noteikt jau 1-4 nedēļas pēc inficēšanās. i., pat pirms serokonversijas, kas ievērojami samazina "loga periodu".

Turklāt ar šādu HIV testu asinīs tiek konstatētas antivielas pret HIV-1 un HIV-2 (izmantojot antigēna-antivielu reakciju), kas tiek ražotas pietiekamā daudzumā, lai pēc 2-8 nedēļām no brīža noteiktu testu sistēmu. no infekcijas.

Pēc serokonversijas antivielas sāk saistīties ar p24 antigēnu, kā rezultātā tiek iegūts pozitīvs HIV antivielu tests un negatīvs p24 tests. Tomēr pēc kāda laika asinīs vienlaikus tiks konstatētas gan antivielas, gan antigēns. Galu galā AIDS tests pret HIV antivielām var dot negatīvu rezultātu, jo tiek traucēts antivielu veidošanās mehānisms.

HIV infekcijas stadijas

Inkubācijas periods jeb “seronegatīvā loga periods” ir laiks no inficēšanās brīža līdz vīrusu aizsargājošo antivielu veidošanās asinīs, kad HIV antivielu testi ir negatīvi, bet cilvēks jau var pārnest vīrusu uz citi cilvēki. Šī perioda ilgums ir no 2 nedēļām līdz 6 mēnešiem.
Akūts periods HIV infekcija rodas vidēji 2-4 nedēļas pēc inficēšanās un ilgst aptuveni 2-3 nedēļas. Šajā posmā dažiem cilvēkiem vīrusa aktīvas replikācijas dēļ var attīstīties nespecifiski gripai līdzīgi simptomi.
Latentā stadija ir asimptomātiska, bet tās laikā pakāpeniski samazinās imunitāte un palielinās vīrusa daudzums asinīs.
AIDS (iegūtā imūndeficīta sindroms) ir HIV infekcijas beigu stadija, kurai raksturīgs smags imūnsistēmas nomākums, kā arī blakusslimības, encefalopātija vai. onkoloģiskās slimības.

Neskatoties uz to, ka HIV infekcija ir neārstējama, mūsdienās pastāv ļoti aktīva pretretrovīrusu terapija (ART), kas var būtiski paildzināt HIV inficēta cilvēka mūžu un uzlabot tā kvalitāti.

Šim testam ir īpaši augsta diagnostiskā vērtība, ja HIV infekcija notikusi īsi pirms pārbaudes laika (2-4 nedēļas).

Kam tiek izmantoti pētījumi?

Analīze tiek izmantota agrīna diagnostika HIV, kas palīdz novērst turpmāku vīrusa pārnešanu citiem cilvēkiem, kā arī savlaicīgi uzsākt pretretrovīrusu terapiju un tādu slimību ārstēšanu, kas veicina HIV infekcijas progresēšanu.

Kad ir plānots pētījums?

Pastāvīgi simptomi (2-3 nedēļas) ar neskaidru etioloģiju: subfebrīla temperatūra, caureja, svīšana naktī, pēkšņs svara zudums, paaugstināts limfmezgli.
Ar atkārtotu herpes infekciju, vīrusu hepatītu, pneimoniju, tuberkulozi, toksoplazmozi.
Ja pacients cieš no seksuāli transmisīvām slimībām (sifiliss, hlamīdijas, gonoreja, dzimumorgānu herpes, bakteriāla vaginoze).
Ja pacientam ir bijis neaizsargāts vaginālais, anālais vai orālais sekss ar vairākiem seksuālajiem partneriem, jaunu partneri vai partneri, par kura HIV statusu pacients nav pārliecināts.
Kad pacientam tika veikta asins pārliešanas procedūra (lai gan inficēšanās gadījumi šādā veidā ir praktiski izslēgti, jo asinis tiek rūpīgi pārbaudītas attiecībā uz vīrusu daļiņu klātbūtni un tiek pakļautas īpašai termiskai apstrādei).
Ja pacients ir injicējis zāles, izmantojot nesterilus instrumentus.
Grūtniecības/grūtniecības plānošanas laikā (AZT grūtniecības laikā, ķeizargrieziens, lai izvairītos no vīrusa pārnešanas bērnam brīdī, kad tas iziet cauri dzemdību kanālam, un nebarošana ar krūti samazina HIV pārnešanas risku no mātes bērnam no 30%. līdz 1%).
Nejauša injekcija ar šļirci vai citu priekšmetu (piemēram, medicīnisku instrumentu), kas satur inficētas asinis (šādos gadījumos infekcijas iespējamība ir ārkārtīgi zema).

HIV infekcija tiek klasificēta kā nekontrolējama slimība, jo trūkst metodes tās specifiskai profilaksei un nepietiekama terapijas efektivitāte. Tāpēc HIV infekcijas epidemioloģiskās situācijas kontrolei šobrīd galvenokārt tiek izmantoti skrīninga diagnostikas pētījumi. Starp HIV infekcijas diagnostikas metodēm vadošo vietu ieņem enzīmu imūnsorbcijas tests (ELISA), kas ļauj izmeklētajiem indivīdiem identificēt šīs slimības izraisītāja seroloģiskos marķierus.

Šajā ziņojumā ir sniegti HIV antivielu noteikšanas rezultāti 40 823 cilvēku, tostarp pacientu, asins serumā. pirmsdzemdību klīnikas, poliklīnikas, pilsētas slimnīcas, kā arī medicīnas centri, kas specializējas riska pacientu (narkomānu, vīrushepatīta B, C un seksuāli transmisīvo slimību slimnieku) izmeklēšanā un ārstēšanā. Pētījumi tika veikti 2005. gadā nosauktajā Dzemdību un ginekoloģijas zinātniskā institūta imunoloģijas laboratorijā. PIRMS. Ott no Krievijas Medicīnas zinātņu akadēmijas, kuram ir vairāk nekā 15 gadu pieredze ELISA metožu izmantošanā dažādu infekcijas slimību diagnostikā.

Sākotnējai asins seruma paraugu pārbaudei tika izmantota CombiBest anti-HIV-1 + 2 testu sistēma (ZAO Vector-Best, Novosibirska), kas izmeklētajos cilvēka paraugos nosaka kopējās specifiskās antivielas pret HIV-1 un HIV-1. serums vai asins plazma.2 (imūnglobulīnu klases A, G un M). Šajā diagnostikas komplektā rekombinantie HIV proteīni tiek izmantoti gan imobilizācijai tablešu iedobēs, gan kā konjugāts ar mārrutku peroksidāzi. Seruma analīzes rezultāti tika novērtēti saskaņā ar testēšanas sistēmas norādījumiem: negatīvi (nesatur HIV-1 un HIV-2 antivielas) tika uzskatīti par testa paraugiem, kuru optiskais blīvums (OD) ELISA testā nepārsniedza. ODcrit vērtība.

Pārbaudot laboratorijā, 40 222 (98,5 %) no 40 823 seruma paraugiem tika konstatēti ELISA negatīvi, un 601 (1,5 %) no pārbaudītajiem paraugiem tika uzskatīti par sākotnēji pozitīviem. Nākamajā dienā atkārtoti analizējot katru no 601 seruma dublikātos (divas tabletes iedobes), 440 (73,2%) paraugi tika identificēti kā pozitīvi un 161 (26,8%) paraugi tika identificēti kā negatīvi. Saskaņā ar Veselības un sociālās attīstības ministrijas ieteikumiem 440 skrīninga pozitīvie serumi tika sasaldēti un nodoti papildu apstiprinošajiem pētījumiem slimnīcas Nr. S.P. Botkina. Šie pētījumi tika veikti, izmantojot ELISA testu sistēmas “ECOlab-Vironostics HIV 1.2 Ag/Ab” (“ECOlab”, Elektrogorsk), “Genscreen Plus”. HIV Ag-Ab” (BioRad, ASV), kā arī imūnblotu komplektus. 440 serumu analīzes rezultāti apstiprinošajos testos ļāva secināt, ka 323 (73,4%) paraugi ir pozitīvi, bet 102 (23,2%) - negatīvi. 15 pārbaudītajiem paraugiem (3,4%) tika iegūts nenoteikts analītiskais rezultāts.

Jāņem vērā, ka OD vērtības, kas iegūtas mūsu laboratorijā to sākotnējās testēšanas laikā, izmantojot CombiBest anti-HIV-1+2 testa sistēmu 314 (97,2%) no šiem 323 pozitīvajiem serumiem, bija robežās no 0,900 līdz 1,780 un 9. (2,8%) paraugi - 0,500–0,900. OD vērtības, kas iegūtas, pārmeklējot 102 negatīvus serumus 52 paraugiem (51%), bija robežās no 0,195 līdz 0,400; 40 (39,2%) paraugiem - 0,401–0,800; 10 (9,8%) paraugi - vairāk nekā 0,800.

Tādējādi veiktā darba rezultātā tika pierādīts, ka primārā asins serumu izmeklēšana HIV infekcijas seroloģisko marķieru klātbūtnei, izmantojot CombiBest anti-HIV-1+2 testu sistēmu, ir ļoti efektīva. Pozitīvi skrīninga rezultāti tika apstiprināti ar papildu pētījumiem references laboratorijā 73% gadījumu, un viltus pozitīvi rezultāti tika reģistrēti tikai 0,25% no 40 823 analizētajiem serumiem.

Apraksts

Sagatavošana

Indikācijas

Rezultātu interpretācija

Apraksts

Noteikšanas metode Enzīmu imūnanalīze (ELISA).

Materiāls tiek pētīts Serums

Iespējama mājas vizīte

Kombinēta antivielu noteikšana pret HIV 1. un 2. tipa un HIV p24 antigēnu, kvalitatīvs tests.

Uzmanību. Pozitīvu un šaubīgu reakciju gadījumā rezultāta izsniegšanas termiņš var tikt pagarināts līdz 10 darba dienām. HIV (cilvēka imūndeficīta vīruss), kas izraisa AIDS (iegūtā imūndeficīta sindromu), pieder retrovīrusu ģimenei. Tas tiek pārnests no cilvēka uz cilvēku, izmantojot piesārņotas adatas un šļirces intravenozai narkotiku lietošanai vai terapeitiskām procedūrām, dzimumakta laikā gan heteroseksuāli, gan homoseksuāli. Vīrusa pārnešana var notikt ar inficētu asiņu un to produktu pārliešanu, orgānu vai sēklu šķidruma nodošanu, veselības aprūpes darbiniekiem - ievainojot ar inficētām adatām vai instrumentiem. HIV infekcija ir iespējama ar tās pārnešanu no inficētas mātes bērnam (vertikāls ceļš), lai gan mūsdienu profilakses metodes, izmantojot pretretrovīrusu terapiju, ja tiek ievēroti visi ieteikumi, var samazināt šo risku līdz minimumam.

Vīrusa mijiedarbības process ar šūnu ietver vairākus posmus: vīrusa saistīšanās ar šūnu, tā izdalīšanās no čaumalas, iekļūšana citoplazmā, DNS sintēze no vīrusa RNS un vīrusa DNS integrācija šūnas genomā. saimniekšūna. Pēc tam sākas latentā infekcijas stadija. Šajā stāvoklī provīrusu DNS var pastāvēt kādu laiku, neuzrādot aktivitāti un neietekmējot saimniekšūnas dzīvībai svarīgo aktivitāti. Kamēr nav vīrusu proteīnu ekspresijas, nav imūnās atbildes pret vīrusu. Antivielas pret HIV, kas raksturo organisma imūnreakciju, parādās pēc vīrusa DNS aktivizācijas un vīrusa aktīvās reprodukcijas sākuma. Latentā perioda ilgums ir atkarīgs no vairākiem faktoriem, tostarp no organisma individuālajām ģenētiskajām īpašībām.

Antivielas pret HIV var parādīties, sākot ar otro nedēļu pēc inficēšanās; to saturs palielinās 2-4 nedēļu laikā un saglabājas daudzus gadus. 90-95% inficēto tie parādās pirmajos trīs mēnešos pēc inficēšanās, 5-9% - laika posmā no trim līdz sešiem mēnešiem, 0,5-1% - vēlāk.

Pirmajās inficēšanās nedēļās, pat pirms antivielu parādīšanās pret vīrusu (t.i., pirms serokonversijas), seruma vai plazmas paraugos var noteikt HIV antigēnu, tostarp tā p24 kapsīda proteīna, klātbūtni. Vēlāk, pēc serokonversijas, tas parasti kļūst nenosakāms.

Ceturtās paaudzes kombinētie testi, piemēram, HIV Ag/Ab Combo tests (Architect, Abbott), nosaka gan HIV 1. un 2. tipa antivielas, gan HIV p24 antigēnu, ļaujot laikus noteikt infekciju. INVITRO laboratorijā HIV infekcijas noteikšanai izmantotā skrīninga testa īpatnības ietver augstu pētījuma specifiku (> 99,5%); Testa 100% jutība pret antivielām, kas raksturīgas serokonversijas periodam, un testa jutība pret p24 antigēnu ir aptuveni 18 pg/ml.

HIV laboratoriskās pārbaudes procedūru stingri reglamentē Krievijas Federācijas Veselības ministrijas rīkojumi, un tā ietver HIV antivielu klātbūtnes skrīninga (skrīninga) pētījuma stadiju, izmantojot enzīmu imūnanalīzes (ELISA) metodes, kas apstiprinātas lietošanai. , un pārbaudes (apstiprinoša) detalizētāka pētījuma stadija pilsētas AIDS centra laboratorijā. Jāņem vērā, ka pat labākās skrīninga ELISA sistēmas negarantē 100% specifiskumu, tas ir, pastāv zināma iespēja iegūt nespecifiskus, viltus pozitīvus rezultātus, kas saistīti ar pacienta asins seruma īpašībām. Tāpēc pozitīvs skrīninga ELISA rezultāts var neapstiprināties apstiprinošajos testos, pēc kuriem pacientam tiks piešķirts negatīvs vai nenoteikts rezultāts. Ja apstiprinošā pētījuma rezultāts ir nenoteikts, testēšana jāatkārto dinamikā pēc 2-3 nedēļām.

HIV infekcijas laboratoriskajai diagnostikai bērniem, kas dzimuši HIV inficētām mātēm, ir savas īpatnības. Mātes antivielas pret HIV (IgG klase) var cirkulēt viņu asinīs līdz 18 mēnešiem no dzimšanas brīža. Tas, ka jaundzimušajiem nav antivielu pret HIV, nenozīmē, ka vīruss nav šķērsojis placentas barjeru. HIV inficētu māšu bērniem 36 mēnešu laikā pēc dzimšanas tiek veikta laboratoriskā diagnostika.

Sagatavošana

Īpaša sagatavošana nav nepieciešama. Asins paraugus ieteicams ņemt ne agrāk kā 4 stundas pēc pēdējās ēdienreizes. Var atrast vispārīgus ieteikumus, kā sagatavoties pētījumam. Testu HIV antigēna un antivielu noteikšanai vēlams veikt ne agrāk kā divas nedēļas pēc iespējamās inficēšanās, negatīva rezultāta gadījumā to atkārtojot pēc trim un sešām nedēļām. Pieteikumu reģistrācija pētījumiem SIA INVITRO notiek pēc pases vai to aizstājoša dokumenta (migrācijas karte, pagaidu reģistrācija dzīvesvietā, dienesta apliecība, izziņa no pasu nodaļas pases nozaudēšanas gadījumā, reģistrācijas karte no viesnīcas). Iesniegtajā dokumentā jābūt informācijai par pagaidu vai pastāvīgu reģistrāciju Krievijas Federācijas teritorijā un fotogrāfijai. Ja nav pases (to aizstājoša dokumenta), pacientam ir tiesības iesniegt anonīmu iesniegumu par biomateriāla piegādi. Ar anonīmu izmeklēšanu iesniegumam un no klienta saņemtajam biomateriāla paraugam tiek piešķirts numurs, kas zināms tikai pacientam un medicīniskajam personālam, kurš veicis pasūtījumu. ! Anonīmi veikto pētījumu rezultātus nevar iesniegt hospitalizācijai, profesionālajām pārbaudēm, un tie nav jāreģistrējas ORUIB.

Indikācijas iecelšanai amatā

Limfmezglu palielināšanās vairāk nekā divās zonās.
Leikopēnija ar limfopēniju.
Nakts svīšana.
Pēkšņs svara zudums nezināma iemesla dēļ.
Caureja vairāk nekā trīs nedēļas nezināma iemesla dēļ.
Nezināma iemesla drudzis.
Grūtniecības plānošana.
Pirmsoperācijas sagatavošana, hospitalizācija.
Sekojošu infekciju vai to kombināciju identificēšana: tuberkuloze, atklāta toksoplazmoze, bieži recidivējoša herpesvīrusa infekcija, kandidoze iekšējie orgāni, recidivējoša herpes zoster neiralģija, ko izraisa mikoplazmas, pneimocistis vai legionellas pneimonija.
Kapoši sarkoma jaunībā.
Ikdienas sekss.

Rezultātu interpretācija

Pārbaudes rezultātu interpretācija satur informāciju ārstējošajam ārstam, un tā nav diagnoze. Šajā sadaļā sniegto informāciju nevajadzētu izmantot pašdiagnostikai vai pašapstrādei. Precīzu diagnozi nosaka ārsts, izmantojot gan šīs izmeklēšanas rezultātus, gan nepieciešamo informāciju no citiem avotiem: anamnēzi, citu izmeklējumu rezultātus u.c.

Mērvienības Neatkarīgajā laboratorijā INVITRO: kvalitatīvais tests. Rezultātu noformēšanas forma: ja nav antivielu pret HIV 1 un 2 un p24 antigēnu, atbilde ir “negatīva”. Ja skrīninga ELISA testā tiek konstatētas antivielas pret HIV vai antigēns, seruma paraugs tiek nosūtīts analīzei ar apstiprinošu imūnblota metodi uz pilsētas AIDS centru, kas pārbauda pozitīvos un nenoteiktos rezultātus.

Pozitīvs rezultāts:

HIV infekcija;
kļūdaini pozitīvs rezultāts, kam nepieciešami atkārtoti vai papildu pētījumi*);
pētījums nav informatīvs bērniem līdz 18 mēnešu vecumam, kas dzimuši HIV inficētām mātēm.

*Skrīninga testu sistēmas HIV 1 un 2 antivielu un HIV 1 un 2 antigēnu (HIV Ag/Ab Combo, Abbott) specifika pēc reaģenta ražotāja aplēsēm ir aptuveni 99,6% gan vispārējā populācijā, gan pacientu grupā ar potenciālie traucējumi (HBV, HCV, masaliņas, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. u.c. infekcijas, autoimūnas patoloģijas (t.sk. reimatoīdais artrīts, antinukleāro antivielu klātbūtne), grūtniecība, paaugstināts līmenis IgG, IgM, monoklonāla gammopātija, hemodialīze, vairākas asins pārliešanas).

Patenta RU 2283497 īpašnieki:

Izgudrojums attiecas uz biotehnoloģijas un medicīnas jomu. Enzīmu imūndeficīta testu sistēma, lai identificētu antivielu spektru pret cilvēka imūndeficīta vīrusu (HIV) pirmā un otrā tipa, pirmā tipa O grupai un antigēna noteikšanai cilvēka imūndeficīta vīrusa pirmajam tipam p24, ietver uz imūnsorbentu bāzes. uz cilvēka imūndeficīta vīrusa antigēniem, kas pārstāv gp41 (env HIV-1 un HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antivielas pret HIV antigēnu 1 p24 , un noteikšanas reaģenti, savukārt iepriekš minētie HIV antigēni un HIV antivielas tiek sorbēti dažādās plātņu iedobēs fermentu imūnanalīzei, un sorbcijai tiek izmantotas 96 iedobju polistirola saliekamās vai nesaliekamās plāksnes. Izgudrojums nodrošina paaugstinātu jutību, vienkāršošanu, rezultātu vērtēšanas subjektivitātes izslēgšanu. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 ill.

Izgudrojums attiecas uz biotehnoloģijas un medicīnas jomu. Lietošana: diferencēta visu klašu specifisko antivielu noteikšana pret cilvēka imūndeficīta vīrusa 1 un 2 proteīniem, HIV 1 O grupas un HIV 1 p24 antigēnu.

Būtība: enzīmu imūntestu sistēmas iegūšana visu klašu antivielu spektra noteikšanai pret atsevišķiem proteīniem un HIV 1 un 2, HIV 1 O grupas un HIV 1 p24 antigēniem asins serumā (plazmā), imūnglobulīniem un asins preparātiem, lai identificētu. antivielu spektru pret HIV 1 un 2, HIV 1 O grupu, HIV 1 p24 antigēna noteikšanu un pozitīvu vai nenoteiktu HIV 1 un 2 antivielu, HIV 1 grupas O un HIV 1 p24 antigēnu skrīninga rezultātu apstiprināšanu.

IZGUDROJUMA APRAKSTS

HIV infekcijas laboratoriskā diagnostika balstās uz trīs jomām: a) HIV un tā sastāvdaļu indikāciju; b) antivielu noteikšana pret HIV; c) imūnsistēmas izmaiņu noteikšana. No esošajām laboratoriskās diagnostikas metodēm visizplatītākās ir seroloģiskās metodes - vīrusu antigēnu antivielu noteikšana.

Lai noteiktu antivielas HIV infekcijas gadījumā, galvenokārt izmanto ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu (ELISA) un imūnblotēšanu (IB). ELISA pamatā ir vīrusu antigēnu imobilizācija uz plāksnēm, kas saista pacienta antivielas, un antigēnu-antivielu kompleksu nosaka, izmantojot mārrutku peroksidāzi konjugētas peles monoklonālās antivielas pret cilvēka imūnglobulīniem G un M. Metode ir diezgan specifiska un jutīga un ļauj atklāt vīrusam specifiskas antivielas 95% pacientu. Atlikušie 5% gadījumu rodas infekcijas sākumposmā, kad asins serumā vēl ir maz antivielu, vai slimības beigu fāzēs, kad organisms vairs nespēj sintezēt antivielas sakarā ar strauju asins seruma izsīkumu. imūnsistēma. Iespējami arī viltus pozitīvi ELISA rezultāti, galvenokārt pacientiem ar autoimūnām un onkoloģiskām slimībām, kā arī Eshptein-Barr vīrusa izraisītām infekcijām. Šajā gadījumā rodas antivielu krusteniskā reakcija pret reimatoīdo faktoru, Epšteina-Barra vīruss vai antigēnu determinantiem, kas ir līdzīgi galvenajiem histokompatibilitātes kompleksa 1. un 2. klases proteīniem (HLA-4 un DQW3) un spēj saistīties ar HIV antigēniem. Viltus pozitīvus rezultātus bieži novēro grūtniecēm un gados vecākiem cilvēkiem. Neuzticamu rezultātu cēlonis var būt arī hemolīze, lipēmija, serumu bakteriālais piesārņojums.

Šajā sakarā ir ierosinātas un izmantotas vairākas metodes, lai pārbaudītu antivielu noteikšanas rezultātu specifiskumu. No šīm metodēm visbiežāk izmantotā reakcija ir "imūnblots" modifikācijā "Western Blot". Metodes būtība ir šāda: pirmajā posmā HIV proteīnus atdala pēc molekulmasas, izmantojot poliakrilamīda gēla elektroforēzi. Tam seko elektroforētiskā pārnešana no poliakrilamīda gēla uz nitrocelulozes membrānas virsmu. Šādā veidā pārnestos antigēnus uz membrānas nosaka, izmantojot netiešo analīzi: membrānu inkubē ar testa materiālu; saturošās antivielas saistās ar HIV antigēniem, kas pārnesti uz nitrocelulozes membrānu, pēc tam membrānas sloksnes inkubē ar konjugātu; veidojoties antigēna-antivielu kompleksam, tam pievienojas konjugāts, pēc atmazgāšanas no konjugāta un inkubācijas ar substrātu notiek to nitrocelulozes sekciju iekrāsošanās, kur veidojas antigēna-antivielas-konjugāta komplekss. Zīmējumā parādīti pozitīvu, vāji pozitīvu un negatīvu imūnblota rezultātu piemēri.

Ar HIV-1 un HIV-2 inficētu personu serumā tiek konstatētas antivielas pret šādiem proteīniem (p) un glikoproteīniem (gp): A tabula.

B tabulā ir norādīti PVO un Krievijas AIDS profilakses un kontroles centra ieteiktie imūnblotēšanas rezultātu novērtēšanas kritēriji.

Pamatojoties uz PVO kritērijiem, serumi tiek uzskatīti par pozitīviem, ja ar IB metodi tiek noteiktas antivielas pret jebkuriem diviem HIV-1 apvalka proteīniem. Ja notiek reakcija tikai ar vienu no apvalka proteīniem (gp160, gp120, gp41), kombinācijā ar reakciju ar citiem proteīniem vai bez tā, rezultāts tiek uzskatīts par apšaubāmu. Saskaņā ar Krievijas Federācijas Veselības ministrijas AIDS profilakses un kontroles federālā zinātniskā un metodiskā centra datiem, serumus ir iespējams interpretēt kā pozitīvus pat tad, ja ir antivielas tikai pret vienu apvalka proteīnu.

Antivielu noteikšana pret p24 antigēnu var norādīt uz serokonversijas sākuma periodu, jo antivielas pret šo proteīnu parādās pirmās. Pozitīvas reakcijas ar gag un pol proteīniem bez reakcijas ar env proteīniem var atspoguļot agrīnas serokonversijas stadiju, kā arī norādīt uz HIV-2 infekcijas klātbūtni vai nespecifisku reakciju.

Imunoblotēšanas kā ekspertu metodes izmantošanai HIV diagnosticēšanai ir vairāki būtiski trūkumi:

1. Nav iespējams apstiprināt HIV 1 p24 antigēna noteikšanu, ja tiek izmantoti testi, kas vienlaikus nosaka antigēnu un antivielas pret HIV, kas padara par nepiemērotu (bezjēdzīgu) skrīninga testu izmantošanu antigēna un antivielu vienlaicīgai noteikšanai. uz HIV (Krievijas Federācijas Veselības ministrijas rīkojums Nr. 292, datēts ar 30.07.2001.: "lai izmeklētu donorus asins pārliešanas stacijās, nepieciešams izmantot testu sistēmas, kas nosaka gan antigēnu, gan antivielas pret HIV").

2. Tikai IgG klases antivielu noteikšana. Nav iespējams pilnībā apstiprināt pozitīvos rezultātus, kas iegūti, izmantojot 3. un 4. paaudzes testus (nosakot IgG un IgM antivielas).

3. Pārbaudes rezultāta interpretācijas subjektivitāte, īpaši "šaubīgu" un "nenoteiktu" rezultātu gadījumos un sākotnējie posmi serokonversija (šajos gadījumos nosakāmās joslas uz nitrocelulozes membrānām ir izplūdušas, ar neapbruņotu aci tik tikko pamanāmas, un bieži vien rodas domstarpības, ja to novērtē dažādi cilvēki).

4. Analīzes rezultātu automatizētas kvantitatīvās novērtēšanas neiespējamība.

5. Zemāka jutība salīdzinājumā ar ELISA.

6. Uzglabāšanas trauslums (uzglabāšanas laikā nitrocelulozes membrānas sloksnes izbalo un nevar būt objektīvs apstiprinājums HIV konstatēšanai vai neatklāšanai strīdīgos gadījumos).

7. Grūtības izveidot reakciju un uzglabāšanu (nitrocelulozes membrānas sloksnes ir ļoti trauslas un bieži saplīst).

8. Augstas IS komplektu izmaksas.

Zināms reaģents, kas ir komplekts antigēnu un antivielu vienlaicīgai noteikšanai pret vienu un to pašu patogēnu, tostarp HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994.). Tomēr netiek izpausta testu sistēma, kas ļauj diagnosticēt HIV infekciju dažādos posmos.

Šī izgudrojuma mērķis ir iegūt testu sistēmu, ar kuras palīdzību ir iespējams apstiprināt pozitīvus vai apšaubāmus skrīninga testu rezultātus pret HIV 1 un 2, HIV 1 O grupas un HIV 1 p24 antigēnu antivielām, izmantojot testus, lai vienlaicīgi noteiktu antigēni un antivielas.

Piedāvātais tehniskais risinājums tiek panākts ar enzīmu imūnanalīzes testa sistēmu, lai identificētu antivielu spektru pret cilvēka imūndeficīta vīrusu (HIV) pirmā un otrā tipa, pirmā tipa O grupas un p24 antigēna noteikšanai pret cilvēka imūndeficīta vīrusu. pirmā tipa p24, kas raksturīgs ar to, ka satur imūnsorbentu, kura pamatā ir cilvēka imūndeficīta vīrusa antigēni, kas ir gp41 (env HIV-1 un HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), antivielas pret HIV antigēnu 1 p24 un noteikšanas reaģentus, kur iepriekš minētie HIV antigēni un HIV antivielas tiek adsorbēti dažādās plātņu iedobēs enzīmu imūnpārbaudei.

Turklāt sorbcijai izmanto 96 bedrīšu polistirola saliekamās vai nesaliekamās plāksnes fermentu imūntestam.

Ar šo izgudrojumu sasniegtais tehniskais rezultāts ir iespēja apstiprināt pozitīvus rezultātus antivielām pret HIV 1 un 2, HIV 1 O grupas un HIV 1 p24 antigēnu, augsta jutība, iespēja automatizēti interpretēt rezultātus, kas novērš HIV subjektivitāti. novērtējums, testa veikšanas vieglums, mazāk nekā ar esošajām izmaksu IS komplektiem.

Šis tehniskais risinājums atšķiras no zināmajiem:

1. Izmantot kā cietās fāzes nesējplāksni imunoloģiskām reakcijām.

2. Antivielu pret p 24 HIV un HIV antigēnu komplekta vienlaicīga lietošana kā sorbents.

Izgudrojumu ilustrē šāds piemērs.

Izstrādātās testu sistēmas "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" aktīvās darbības princips ir:

Imunosorbents - HIV-1 strukturālajiem proteīniem līdzīgi rekombinantie antigēni: gp41 (env HIV-1 un HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) un monoklonālie peles antivielas pret HIV 1(p24) antigēnu, kas atsevišķi adsorbētas uz saliekamās polistirola plāksnes sloksnēm.

Imūnsorbenta sagatavošanai lietošanai:

1. HIV-1 gp41 ir proteīns, ko ražo E. Coli celms Nr. AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 ir proteīns, ko ražo E. Coli celms Nr. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 - proteīns, ko ražo E. Coli celms Nr. AHIV 105.

4. HIV-1 p31 - proteīns, ko ražo E. Coli celms Nr. AHIV 108.

5. HIV-2 p36 - proteīns, ko ražo E. Coli celms Nr. AHIV 106.

Konjugāts 1, liofilizēts vai šķidrs, peles monoklonālās antivielas pret HIV1 p24 antigēnu, konjugētas ar biotīnu.

1. Konjugāts 2, liofilizēts vai šķidrs, rekombinanto antigēnu maisījums, kas līdzīgs HIV-1 strukturālajiem proteīniem: gp41 (env HIV-1 un HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (po1 ); HIV-2: gp36 (env) konjugēts ar biotīnu;

2. Konjugāti 3, 4 - liofilizēts vai šķidrs - streptavidīns, kas iezīmēts ar mārrutku peroksidāzi;

Iepriekšējo pētījumu gaitā tika izvēlēts testēšanas sistēmas dizains, izstrādāta tās komponentu sagatavošanas tehnoloģija un optimizēti fermentu imūntesta veikšanas nosacījumi.

Iestatot ELISA testu sistēmā "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", plāksnes iedobēm ar adsorbētām antivielām pret p24 pievieno 25 μl konjugāta-1 un iedobēs ar adsorbētiem antigēniem - 25 µl konjugāta-2. Reakcijas shēma ir parādīta zemāk. Pēc tam katrā iedobē pievieno 25 μl testa parauga. Tajā pašā laikā iedobēs ar antigēniem krāsa mainās no oranžas uz rozā, bet iedobē ar antivielām - no zaļas uz pelēku. Maisījumu 45 minūtes inkubē 37°C temperatūrā kratītājā (vai 1 stundu 37°C termostatā). Pēc tam bez mazgāšanas tabletes iedobēm pievieno 50 μl konjugāta-3 p24 antigēna noteikšanai, bet antivielu noteikšanas iedobēm pievieno 50 μl konjugāta-4. Pēc 20 minūšu inkubācijas 37°C kratītājā (vai 30 min 37°C termostatā) plāksni mazgā un attīsta ar substrāta maisījumu. Kopējais reakcijas laiks 1 stunda 25 minūtes (vai 1 stunda 50 minūtes). Testa paraugā esošais p24 antigēns saistās ar monoklonālajām antivielām pret p24, un specifiskās antivielas veido kompleksu ar rekombinantiem antigēniem uz plāksnes. Iegūtais imūnkomplekss anti-p24 ar p24 tiek noteikts ar anti-p24-biotīna konjugātiem, pēc tam ar streptavidīna peroksidāzi, un Ag-HIV imūnkompleksus ar At-HIV nosaka ar Ag-biotīna konjugātu, pēc tam ar streptavidīna peroksidāzi. .

Reakcijas iestatīšanas shēma.

Rezultātu uzskaite tiek veikta spektrofotometriski pie diviem viļņu garumiem: 450 /620-680 nm ar instrumentu, kas iestatīts uz "gaiss". Ņemsim vērā rezultātus pie viena viļņa garuma 450 nm.

Analīzes rezultāti tiek ņemti vērā, ja optiskā blīvuma (OD) vidējās vērtības iedobēs ar K- nav lielākas par 0,2, iedobēs ar K+ - ne mazākas par 1,0. OP krit. aprēķina pēc formulas:

OP krit. gp41 = sk. vērtību OP K-(gp41)+0,15

OP krit. gp120 = sk. vērtību OP K-(gp120)+0,15

OP krit. p24 = sk. vērtību OP K-(р24)+0,15

OP krit. p31 = sk. vērtību OP K-(31)+0,15

OP krit. gp36 = sk. vērtību OP K-(gp36)+0,15

OP krit. Ag p24 = sk. vērtību OD līdz- (Ag p24)+0,04

kur 0,15 un 0,04 ir koeficienti, kas noteikti ar ražotāja statistiskās apstrādes metodi. Testēšanas sistēmas izstrādes procesā tika izmantots:

1. Asins seruma paraugi no veseliem donoriem (n=610).

2. Asins seruma paraugi no pacientiem ar dažādām infekcijas slimības nav saistīts ar HIV (ARI, pneimonija, tonsilīts, herpetiskas un citomegalovīrusa infekcijas, sifiliss, hlamīdijas, vīrusu hepatīts A, B un C (n=224)).

3. Asins seruma paraugi pacientiem ar dažādām neinfekcijas slimībām - traumām, sirds un asinsvadu sistēmas slimībām, onkoloģiju (n=35).

4. Grūtnieču asins seruma paraugi (n=40).

5. Asins seruma paraugi, seropozitīvi ELISA un apstiprināti imūnblotā (n=428).

6. Seruma paraugi ar pozitīvu rezultātu, kas iegūts enzīmu imūntestu sistēmās HIV 1,2 antivielu un p24 antigēna vienlaicīgai noteikšanai, un nenoteiktu imūnblota rezultātu (n=123).

7. Seruma iekšējais panelis, kas satur un nesatur antivielas pret HIV 1.2, pārbaudīts ar Krievijas Federācijas Veselības ministrijas reģistrētiem enzīmu imūntestiem un imūnblotu (n=21).

8. Standarts "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Francija, kat. 72217, kas ir antigēns, kas iegūts no vīrusa lizāta.

9. Uzņēmuma iekšējais standarts. Paraugs, kas satur p 24 antigēnu koncentrācijā 200 pg/ml, kas iegūts no vīrusa lizāta un titrēts pēc "HIV 1 ANTIGĒNA STANDARTS" firmas "BIO RAD", Francija, kat. Nr.72217.

10. Standarta panelis serumu, kas satur antivielas pret cilvēka imūndeficīta vīrusu pirmā tipa (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Medico-Biological Union, Novosibirska.

11. Standarta panelis serumu, kas satur antivielas pret cilvēka imūndeficīta vīrusu otrā tipa (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, Medico-Biological Union, Novosibirska.

12. Standarta serumu panelis, kas nesatur antivielas pret pirmā un otrā tipa cilvēka imūndeficīta vīrusu (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Medico-Biological Union, Novosibirska.

Testa sistēmas jutīguma novērtējums p24 antigēna noteikšanai tika veikts, izmantojot uzņēmuma iekšējo standartu "HIV I ANTIGĒNA STANDARTS", "BIO RAD". Izmantojot iekšējo standartu, tika sagatavoti 4 secīgi 2-kārtīgi atšķaidījumi no 40 pg/mL līdz 5 pg/mL ar normālu donora plazmu, kas nesatur HIV 1, 2 antivielas kā šķīdinātāju. Par jutīguma kritēriju tika ņemts mazākais nosakāmā antigēna daudzums. Iegūtie dati ir parādīti 1. tabulā.

Lai novērtētu testa sistēmas jutīgumu specifisku antivielu noteikšanai, tika izmantoti standarta paraugu paneļi, kas satur cilvēka imūndeficīta vīrusa (HIV 1, 2) antivielas (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-28-216- 02P (HIV 2) 003. lpp.).

Iegūtie dati atspoguļoti 3., 4. tabulā.

Testu sistēmas "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" diagnostiskā efektivitāte tika salīdzināta ar testu sistēmām "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostics of HIV Uniform II Ag/Am" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1.2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Šim nolūkam seruma paraugi no iekšējā paneļa tika pārbaudīti visos norādītajos testos. 5. tabulā sniegtie rezultāti norāda uz "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" augsto diagnostisko efektivitāti.

Tika veikti arī testu sistēmas "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" jutīguma pētījumi ar pacientu asins serumiem, kuri imūnblotā apstiprināti kā HIV pozitīvi. Kopumā tika pārbaudīti 428 šo serumu paraugi. Ir iegūtas vairākas iespējas antivielu noteikšanai pret dažādiem HIV proteīniem un p24 antigēnu. Rezultāti ir parādīti 6. tabulā.

6. tabula Antivielu pret dažādiem HIV 1 proteīniem un p24 antigēna noteikšanas rezultāti, pārbaudot HIV 1 pozitīvos serumus (n=428)
% noteikšana	Olbaltumvielu profils
	anti-gr41	anti-gr120	anti-r24	anti-r31	24. lpp
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
% antivielu noteikšana pret atsevišķiem proteīniem vai Ag p24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

Pārbaudot HIV 1 pozitīvos paraugus, 3% serumu uzrādīja pozitīvu reakciju ar gp36 (env HIV 2). MP/OPcrit šajos paraugos nepārsniedza 2,0. Mūsu dati par HIV 1 (gp41) un HIV 2 (gp36) ārējā apvalka proteīnu krustenisko reaktivitāti atbilst literatūras datiem.

Rezultātu interpretācija

HIV pozitīvo serumu un paraugu no standarta un iekšējiem paneļiem testēšanas analīze "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" ļāva izstrādāt kritērijus šī testa rezultātu interpretācijai. Ieteicamie kritēriji ir parādīti 7. tabulā.

Pamatojoties uz šiem kritērijiem, visi HIV pozitīvie seruma paraugi (n=428) tika identificēti kā pozitīvi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1". No 16 standarta paneļa paraugiem, kas satur antivielas pret HIV 1, 14 tika noteikti kā pozitīvi un 2 kā nenoteikti. Visi 8 paraugi no standarta paneļa, kas satur antivielas pret HIV 2, tika noteikti kā pozitīvi. No 10 paraugiem no iekšējā paneļa, kas satur antivielas pret HIV, 1 tika identificēti kā pozitīvi un 3 kā nenoteikti.

Tika veikti arī testu sistēmas "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" jutīguma pētījumi ar pacientu asins serumiem ar pozitīvu rezultātu enzīmu imūnanalīzes testu sistēmās, kas vienlaikus nosaka antivielas un p24 antigēnu, un imūnblotā nenoteikts . Kopumā tika pārbaudīti 123 šādi paraugi. Dati ir parādīti 8. tabulā.

Pārbaudot serumus ar nenoteiktu imūnblota rezultātu (n=123) "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1", 72 paraugi (58,5%) uzrādīja pozitīvu rezultātu. No tiem 26 serumi (21,1%) ir pozitīvi tikai uz p24, 20 (16,3%) - tikai uz antivielām, 16 (13%) - uz p24 ar antivielām pret kādu no olbaltumvielām, 10 (8,1%) - uz p24 ar antivielas pret diviem vai vairākiem proteīniem. Tādējādi, pārbaudot tikai antivielas (netiek konstatēts p24), 30 paraugi (24,4%) būtu pozitīvi. P24 antigēna noteikšana testā ļāva noteikt kā pozitīvus papildu 42 paraugus (34,1%).

Lai novērtētu testa sistēmas specifiku, tika izmantots standarta serumu panelis, kas nesatur antivielas pret HIV 1, 2 (n=20); asins seruma paraugi no veseliem donoriem (n=610), asins seruma paraugi no pacientiem ar dažādām ar HIV nesaistītām infekcijas slimībām (n=224); asins seruma paraugi pacientiem ar dažādām neinfekcijas slimībām - traumām, sirds un asinsvadu sistēmas slimībām, onkoloģiju (n=35); grūtnieču asins seruma paraugi (n=40). Kopumā tika pārbaudīti 929 paraugi. Viens veselu donoru asins seruma paraugs uzrādīja viltus pozitīvu rezultātu – tika konstatētas antivielas pret gp41 un p24. 7 asins serumu paraugi no veseliem donoriem un 2 asins serumu paraugi no pacientiem ar infekcijas slimībām, kas nav saistītas ar HIV, uzrādīja kļūdaini pozitīvu rezultātu p24.

Lai novērtētu testa sistēmas specifiku, tika izmantots standarta negatīvo paraugu panelis (OSO 42-28-214-94-02p, 009. lpp.). Specifiskums bija 100%.

Tādējādi veiktie pētījumi ir parādījuši, ka testu sistēmas "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" specifika ir 99% normālu donoru un pacientu ar dažādām infekciozām asins seruma paraugu izpētē. un somatiskās slimības.

Iegūtie dati liecina par izstrādātās testu sistēmas "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" augsto diagnostisko efektivitāti. Testa sistēmu var izmantot, lai noteiktu antivielas pret atsevišķiem HIV 1. un 2. tipa proteīniem un HIV1 p24 antigēnu, lai apstiprinātu pozitīvu skrīninga rezultātu ar testu sistēmām, kas nosaka antivielas, vai testa sistēmām, kas vienlaikus nosaka antivielas un HIV1 p24 antigēnu. Testa sistēmu var izmantot kā alternatīvu imūnblota testu, lai apstiprinātu pozitīvus rezultātus, kā arī pētītu antivielu dinamiku pret HIV un p24 antigēnu. dažādi posmi infekcijas.

PĀRBAUDES PRIEKŠROCĪBAS

1. Apstiprinājuma enzīmu imūntesta plāksnes formāts

2. Apstiprinošs tests, kas apvieno HIV 1, 2 antivielu spektru un HIV 1 p24 antigēnu

3. Visu Ig klašu antivielu noteikšana

4. Jutība p24 noteikšanai nav mazāka par 5 pg/ml

5. Samazina nenoteiktus rezultātus salīdzinājumā ar imūnblotu

6. Analīzes laiks - 1 stunda 25 minūtes (imūnblots - no 3 līdz 20 stundām)

7. Visu sastāvdaļu un paraugu ieviešanas vizuālais novērtējums.

1. ELISA testa sistēma pirmā un otrā tipa cilvēka imūndeficīta vīrusa (HIV) antivielu spektra identificēšanai, pirmā tipa O grupas un p24 antigēna noteikšanai pret cilvēka imūndeficīta vīrusa pirmā tipa p24 antigēnu. kas raksturīgs ar to, ka satur imūndeficīta vīrusa antigēnus gp41 (env HIV-1 un HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antivielas. HIV antigēnam 1 p24 un noteikšanas reaģentiem, savukārt iepriekš minētie HIV antigēni un HIV antivielas tiek adsorbēti dažādās plākšņu iedobēs fermentu imūnanalīzei.

2. ELISA testa sistēma saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīga ar to, ka sorbcijai tiek izmantotas 96 iedobju polistirola saliekamas vai nesaliekamas plāksnes fermentu imūnanalīzei.